UJI POTENSI SENYAWA MIKROBA

LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI

 

TEKNIK PEWARNAAN BAKTERI 

Disusun oleh :

Ayu Handika Ariyanto     A3-18 /1351810185

Anisa Salsabila                 A3-18 / 1351810190

Salsabila faisal A               A3-18/ 1351810191

Menara hanum hanny S     A3-18/ 1351810195

Yohana mira                      A3-18/ 13518102197

Lailatul munawaroh           A3-18/ 1351810201

Rachmad doni                    A3-18/ 1351810204

                                                                   

                                                                       BAB I

PENDAHULUAN

 Latar Belakang

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung (Dwidjoseputro.1998).

Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro.1998).

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.

Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay.1994)

Oleh karena itu yang melatar belakangi praktek ini yaitu untuk mengetahui teknik pewarnaan mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagian-bagian bakteri.

Tujuan

-           Untuk mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri

-          Untuk mengetahui perbedaan gram positif dan gram negatif

-           Untuk mengetahui jenis-jenis pewarnaan bakteri

-          Untuk mengetahui larutan pewarna yang digunakan pada percobaan pewarnaan

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan

            Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro.1998).

Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas (Hadiutomo. 1990). Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2004). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Hadiutomo. 1990).

Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Waluyo, 2004).

Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Hadiutomo. 1990).

            Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan sitoplasmasewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro.1998).

            Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan (Dwidjoseputro.1998).

Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut pewarnaan positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang yang bermuatan positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negatif latar belakang disekeliling mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup penyiapan mikroorganisme dengan melakukan preparat ulas (Dwidjoseputro.1998)

Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal adari bukan media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya (Sutedjo.1991).

Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka seringkali setelah pembuatan preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh pewarnaan. Fiksasi dapat dilakukan dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol. Fiksasi digunakan untuk :

1.      Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai

2.      Melekatkan bakteri pada glass objek

3.      Mematikan bakteri

Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim, prosedur pewarnaan ini menggunakan zat warna basa seperti seperti crystal violet, biru metilen, karbol fuchsin basa, safranin atau hijau malakit. Kadang kala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah kongo (Lay.1994).

Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat penataan bakteri. Pada coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (stertococcus), buah anggur ( stafilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8 (saranae) (Lay.1994).

Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau nigrosin, kemudian digesekkan diatas kaca objek.Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak berwarna dengan latar belakang hitam (Lay.1994).

Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh seorang ahli bioteknologi dari Denmark yang bernama Christian Gram pada tahun 1884. Menemukan metode pewarnaan secara tidak sengaja. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan itu merupakan tahap penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri (Lay,1994)

Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur 24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif (Lay,1994)

Cirri-ciri gram negative:

-        Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer

-    Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat dalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam laktat.

-       Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

-       Tidak resisten terhadap gangguan fisik

Ciri-ciri bakteri gram positif:

-                  Struktur dindingnya tebal

-                Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal

-                Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin

-                 Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal

-               Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit

-            Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Banyak seenyawa organic berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan gram untuk :

-             Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar

-            Mengidentifikasi bagian-bagian structural sel mikroorganisme

-            Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa

  

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

Alat dan Bahan

A.. Alat-alat

        Mikroskop

        Jarum ose

        Cawan petri

        Bunsen

        Kapas

        Pipet tetes

        Botol

        Beaker gelas

        Gelas piala

        Cover glass

        Kertas saring

        Pinset

        Objek glass

        Gunting

B.  Bahan-bahan

        Alkohol 95%

        Aquades

        Carbol Fuchsin

        Crystal Violet

        Nigrosin

        Tinta cina

        Malachite green

        Lugol’s iodida

        Safranin

        Tisu

        Alkohol 70%

        Biakan murni bakteri

Cara Kerja

A. Pengamatan marfologi mikroba secara mikroskopik

·         Bentuk bakteri

1.      Mempersiapkan kaca objek

2.      Mempersiapkan apusan. Apusan ini dapat berasal dari cairan atau padatan

a)      Biakan cair. Suspense selsebanyak satu atau dua macam jarum inokulasi diletakkan pada kaca objek, lalu diapuskan pada kaca objek selebar 1-2cm. biarkan mongering di udara atau di atas api kecil dengan jarak 25 cm

b)      Biakan padat. Bakteri yang dikulyur pada medium padat tidak dapat langsung dibuat apusan seperti dari biakan cair, tapi harus diencerkan dulu.

Fiksasi dengan pemanasan. Apusan bakteri pada kaca objek bila tidak diletakkan secara kuat, dapat terhapus pada waktu proses pewarnaan lebih lanjut.

-          Warna Gram Bakteri

1.      Pewarnaan gram negative dan pewarnaan postif

2.      Siapkan kaca objek lalu teteskan aquades di atasnya

3.      Buat apusan dari dua biakan bakteri dengan menggunakan jarum inokulum

4.      Difiksasi diatas api Bunsen selama 5 detik

5.      Teteskan larutan Kristal violet diatasnya

6.      Kemudian biarkan selama 60 detik

7.      Siram dengan aquades

8.      Tetskan iodium diatas kaca objek kemudian diamkan selama 60 detik

9.      Teteskan alcohol 70% di atasnya kemudian diamkan selama 30 detik

10.  Teteskan larutan safranin kemudian diamkan selama 60 menit

11.  Teteskan aquades di atasnya

12.  Serap air yang mengenang di atas kaca benda dengan kerta serap

13.  Amati di bawah mikroskop

                                                                         

                                                                          BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Pengamatan

Nama bakteri	Deskripsi	Pengamatan
E- Coli	Bemtuk : basil ( batang ) Warna : merah  muda Gram negative
Bacillus subtilis	Bentuk : basil ( batang ) Warna : ungu Gram positive
Staphylococcus aureus	Bentuk : coccus ( bulat ) Warna : ungu Gram positive
Pseudomonas aeroginosa	Bentuk : basil ( batang ) Warna : merah muda Gram negative

Pembahasan

            Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain : crystal violet, alkohol, safranin, dan iodine (Lay.1994).

Dari hasil pengamatan, pada pewarnaan gram ditemukan bakteri jenis gram negatif dengan warna merah memiliki bentuk basil pada perbesaran mikroskop hingga 400 dan gram positif dengan warna ungu memiliki bentuk batang & bulat pada perbesaran mikroskop 400.

Beberapa faktor kesalahan pada praktikum antara lain pemberian zat warna yang berlebihan sehingga sel bakteri tidak nampak, kurang maksimalnya dalam proses fiksasi sehingga masih ada bakteri yang belum mati, dan faktor yang lain adalah pada proses pencucian terlalu deras dalam membilas zat warna dengan air sehingga dapat menyebabkan bakteri larut terbawa air

BAB V

PENUTUP

Kesimpulan

Dari percobaan pewarnaan yang dilakukan dapat ditarik kesimpulan :

-          Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup

-          Perbedaan pada garam negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada gram positif berwarna ungu kareana dapat mempertahankan zat pewarna kristal violet serta perbadaan terjadi pada dinding selnya

-          Macam-macam pewarnaan anatara lain : pewarnaan sederhana,pewarnaan differensial,pewarnaan spora dan perwarnaan kapsul

-          Larutan zat warna yang digunakan pada percobaan perwarnaan antara lain : alkohol, carbol fuchsin, crystal violet, nigrosin, malachite green, lugol’s iodida, dan safranin.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D.1998.Dasar-Dasar Mikrobiologi, Malang : Djambatan

Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga

Lay, Bibiana.W.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium.Jakarta : Rajawali

Sutedjo, Mul Mulyani.1991.Mikrobiologi Tanah.Jakarta : Rineka Cipta